세포 stock 만들고, 풀기. 세포 얼리고 녹이는 방법

세포 풀기 thawing

cell stock: 장기보관은 액체질소에 보관
곧 사용할 것은 -80℃냉장고에 보관

0. 클린벤치에 필요한 모든 물건들을 미리 다 꺼내둔다
1. cell stock을 냉동고에서 꺼내 water bath 에 넣고 살얼음이 보일 정도까지만 녹인다.
2. 스탁에서 녹은 세포를 따서 코니칼에 새로운 배지(약 9ml)와 녹은 스탁을 넣고 원심분리를 돌린다.
(이때 배지는 많으면 좋다. DMSO가 독성을 띄기 때문에 최대한 희석하기 위해서)
3. 상등액을 석션하고 아래 남은 펠렛에 새로운 배지(약 1ml) 를 넣고 파이펫팅 한다.
4. 새 plate 에 미리 라벨링과 배지를 약 8ml 넣은 상태에서 세포를 plate 에 분주한다.
5. 인큐베이터에 넣고, 다음날 배지만 살짝 석션해 준 뒤 새로운 배지로 조심히 갈아준다

실험은 최소한 1번의 subculture를 한 세포를 사용한다.

세포 얼리기, cell freezing

1. subculture 과정 중 5번부터 시작한다 (=펠렛을 만든다)

2. pellet 에 동결보호제를 넣어서 먼저 –20℃ 냉장고에 넣고 나중에 –80℃, 액체 질소 순으로 천천히 얼려준다

 

사용하는 동결보호제의 종류에 따라서 다름

회사에 따라서 다름으로 구매시 확인하고 들은 설명대로 실험할 것.

 

 

 

동결보호제, cryoprotective agent

*cell freezer : 판매함, plus 제품은 1 바이얼에 1ml 사용, 기본 제품은 DMSO를 넣어서 사용

*FBS + DMSO (9:1) 로도 사용 가능

 

DMSO (dimethylsulfoxide)

cryopreservation 할 때 세포 손상을 방지하고, 어는점 낮춰서 동결속도를 느리게 해주는 친구로 안정적인 냉동을 도와주지만 세포독성이 있음.

 

*동결보호제가 없으면 intracellular crystal 이 세포막이나 세포소기관 찔러서 다치고, 삼투압이나 용매농도 상승으로 쪼글쪼글해지는 등 문제가 많음