Cell seeding 하는 법

안녕하세요, 란테입니다.

 졸업하고 한참~뒤에야 작성하는 셀 시딩하는 방법, 셀 개수 세는 방법입니다.

재학당시에 찍어둔 사진이용해서 설명드려볼게요~

 

Cell seeding, cell counting , 셀 깔기, 셀 시딩, 세포 수 세기 다 같은 말인거 아시죠~?ㅎㅎ

꼭 동물세포 아니더라도 미생물도 유사한 방식으로 셉니다!저는 동물세포 이용해서 실험진행했어서 배지 색이 붉은색이에요~

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방법. 함께 해봅시다

1. 필요한 총 세포 수 계산하기

Cell seeding (셀 깔기)를 위해서는 먼저 얼마만큼의 세포를 쓸껀지, 나는 지금 얼마만큼의 세포가 있는지 세포수를 세어서 알아야겠죠?

실험실마다 다르겠지만, 이번에 제가 사용할 well은 8well plate로 한 칸에 1.3만cell 이면 충분했어요. 4칸만 채워볼게요

 

필요한 세포 수 X 필요한 well(칸) 수 = 필요한 총 세포 수

 

하지만 파이펫팅하다가 오차가 생길 수 있으니까,

필요한 well 보다 한두개 정도 더 더해줘서 만드는게 좋아요

 

필요한 세포 수 X (필요한 well(칸) 수+1~5 ) = 필요한 총 세포 수

 

1.3만 cell X (4 + 1) = 6.5만 cell 이 필요하네요!

저는 손이 익어서 +1 well 만 했지만, 초보시라면 +5well 정도 하셔도 됩니다~

그러면 1.3만 cell X (4+5) = 11.7만 cell 필요하겠죠?

 

2. 세포 펠렛 (pellet) 풀기

세포를 배양한 판( ex 100파이) 에서 떼서  원심분리기를 이용해서 세포 펠렛 (pellet)만 뭉쳐두셨다면,

 

 

위에 배지 (배양한 데서 뗀거라 뗄 때 쓴 트립신이 섞여있어 안좋음)를 석션하고,

펠렛 양을 보고 (얼마나 두꺼운가) 적절하게 새로운 배지를 약1~3ml 넣고 파이펫팅을 해서 풀어주세요

다 아시겠지만 아래 흰색이 세포입니다

 

저 아래 펠렛 보이시죠?

초록 동그라미 안에 있어요 (흰색은 얼려서 스탁 만들꺼라, 동결보호제 넣어서 흰색이에요 이번엔 무시!)

 

여기에서 세포 펠렛 (pellet)의 양을 얼마나 남겨야 할지, 또 새로운 배지를 1, 2, 3 ml 중 얼마를 넣어야하는지는 직접해보시면서 감을 잡으시면 됩니다. (학부생 실험이라면 조교님께서 대강 계산해서 주셨을거에요)

 

하나도 모르시겠는 분을 위해 설명하자면, 원심분리 돌린 코니칼에는 세포 + 트립신 + 세포를 땔 때 사용한 배지 가 들어있잖아요, 그중에서 세포만 원심분리로 가라앉게 하고 위에 액체들은 다 석션해서 버리고 새로운 배지(1~3ml) 로 뭉친 세포 펠렛을 풀어주는 과정이 생략되어있는겁니다

 

3. 헤모사이토미터 (hemocytometer)로 세포 수 세기

헤모사이토미터(hemocytometer) 를 준비해주세요 숫자 셀 찰칵이…? ㅋㅋㅋㅋ도 준비해주세요

헤모사이토미터(hemocytometer) 의 금속부분과 여기에 딱 맞는 커버글라스 각각을 알콜뿌린 킴테크로 먼지 없게 잘잘 닦아주세요

그 다음에 이렇게 착 붙이고 흔들리지 않도록 양쪽 끝을 왼쪽 사진처럼 잡아주세요

옆에서 보면 이런 모습이에요

방금 풀어준 세포용액을 (블루팁, 1000ul, 1ml 추천) 로 잘 파이펫팅하고

10p 팁을 이용해서 10ul 따서 헤모사이토미터 (hemocytometer)의 양쪽에 각각 넣어주세요

버블 생기지 않게 한방에 훅 넣어주시면 됩니다

 

이렇게 팁 모양으로 파인 부분에 천천히 넣는다는 느낌보다는 용액을 쏜다는 느낌으로 해주시면 됩니다.

이때 기포가 들어가면 안좋아요ㅜㅜ 그럼 세포 수 셀 때 부정확해져서 그럴 경우에는 다시 유리 떼고 에탄올 뿌린킴테크로 닦고 다시 하시면 되어요

 

4. cell 수 카운팅counting 하기

 

현미경에 잘 올려두고, 초점 잘 맞추고

중간에 있는 네모 안에서만 세포수를 잘 세주세요

찰칵이를 사용해서 하면 숫자세기가 편합니다.

테두리에 걸쳐 있는 친구는 4개의 가상자리중에 2곳만 세던지 아니면 4곳 모두 다 세던지 항상 일정하게 통일만 시키시면 됩니다 

트립신으로 세포를 떼어냈기 때문에 세포가 동그란 모양이에요

저희가 하나의 헤모사이토미터에 위 아래로 2번 세포를 넣었기 때문에 각각 두번 세서 저는 40, 35가 나왔어요

이때 센 두개의 숫자의 차이가 10% 미만일 때만 세포 펠렛을 잘 풀었다고 볼 수있어요 다르게 나오면 다시 파이펫팅하고 헤모사이토미터 다시 준비하시면 됩니다 (파이펫팅이 잘 되지 않아서, 부정확하다고 생각하기 때문)

5. 계산하기

자 이제 계산을 해봅시다

저희가 헤모사이토미터로 계산한 40, 35 의 평균인 37.5 만셀이 있는거에요 (세포 펠렛 푼 코니칼 1ml에)

(40+35  )/ 2 = 37.5 만셀 입니다 (그냥 뒤에 만셀이라는 단어를 습관처럼 붙여서 써요)

 

37.5* 10^4 cell 있는거죠 코니칼 1ml 에! (이 과정이 이해가 안가면 8번으로 ㄱㄱ)

 

저희가 오늘 실험에 필요한 세포는 1번에서 6.5만cell 필요하다 계산했어요

분자에  필요한 cell 수 / 분모에 코니칼 1ml에 있는 세포 수 = 전체 코니칼중에서 몇 ul을 사용할지

 

숫자로 생각하면

6.5 X 10^4 cell / 37.5 X 10^ 4 cell = 0.173mL = 173uL 쓰는겁니다

 

사진에 초록색 부분까지 이해하셨나요??

그러면 오늘 사용할 plate 에 총 필요한 배지의 양을 계산해주세요

저는 작은 8well plate 의 절반만 쓸꺼라서 (4well+1well)  X 500uL = 2500uL = 2.5mL

 

새로 필요한 배지는 2.5mL 인데 저희가 세포가 담긴 코니칼에서 사용할 계산한 173uL를 넣으면 총 부피가 바뀌니까

new 코니칼에 배지 (2.5ml-173ul)  + 세포있는 배지 173uL = 총 배지+ 세포 2.5ml 만드시면 됩니다.

 

6. 계산 완료한 세포 plate 에 분주하기

새 코니칼에 계산한 2.5ml의 세포+배지 용액을 각 well 에 정해진 양 (ex 500ul) 씩 고르게 잘 분주해주면,

파이펫팅을 잘 했다면 정확하게 추가했던 1개의 well 만큼의 분량이 남겠죠?ㅎㅎ

 

잘 흔들어서 세포가 고르게 분포할 수 있게 해주시고 현미경으로 꼭 한번 확인해주세요 충분히 single cell 로 쫙 고르게 퍼졌는지요~

 

7. 남은 세포들 다시 subculture 해서 배양기에 넣기

 

여기까지 다 잘했으면 이제 남은 세포를 다시 100파이나, T75 T25등 원래 키웠던 plate 에 다시 분주해서 배양기에 넣어줍니다

신입생 친구들 보면 세포 까는 것에 너무 집중해서 남은 세포들 석션해서 버리는 친구들 있더라구요

남은 세포들 또 잘 키워서 다음 실험에 써야하니까 관리 잘 해줍시다ㅎㅎ

 

8. 세포 단위가 이해가 안가요?!

아까 헤모사이토미터 부피를 생각해보면, 우리가 10uL의 용액을

(가로) 1mm X (세로)1mm X (높이) 0.1mm = 0.1 mm^3 의 공간에 넣은거고,

0.1 mm^3 = 0.1 uL = 10^-4 mL 이죠

숫자 계산을 한 37.5는 사실 37.5 cell / 10^-4mL 가 생략된 글자로, 해당하는 부피 (10^-4 ml)에 37.5 cell 이 있다는 말을

매번 그렇게 부르기 기니까 37.5 라고 말한거에요

 

우리는 코니칼 1ml에 몇 개의 cell 이 있는지가 궁금하니까, (그래야 계산을 편하게 하겠죠?) 

단위를 맞추기 위해 10^4 를 곱해서 37.5만셀 (1ml에) 있군! 하는겁니다

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정말 간단한 내용이긴한데, 그래도 자세하게 정리해보았어요

새로운 신입생이나 학부생분들에게 도움이 되었으면 좋겠네요!