※쓰다가 단위가 잘못됐다는걸 알았지만 이 자료를 참고하실 똑똑이들은 알아서 잘 보실꺼라고 생각합니다..하하※
1. Transformation
2. Abstract
이번 실험은 bacteria 에 Pks(-), PACYC 184 플라스미드를 넣어서 형질전환을 하는 것에 목적이 있다. 실험에 사용된 Pks(-)와 PACYC 184 에는 Ampicllin과 chloramphenicel 항생제에 내성 유전자가 있어 실험에서 성공적으로 transformation 된 bacteria 는 각각의 항생제가 있는 배지에서 살아남을 수 있고, 우리는 살아남은 CFU를 계산해서 효율을 구할 수 있었다. 그렇게 구한 본조의 효율은 Pks(-)=1.83*10^6 CFU/ug DNA , PACYC184=1.83 *10^5 CFU/ug DNA , 로 구했다. 본조를 포함한 다른조들의 결과값도 비교해보면 Pks(-)가 PACYC 184 보다 효율이 높은 것을 알 수 있는데, 두가지 이유때문에 이러한 결과가 나왔다고 추측한다. 첫번째로 플라스미드 DNA의 크기 차이이다. Pks(-)는 약 3.0kb, PACYC 184는 약 4.2kb의 크기를 가져서 electroporation 시에 크기가 더 작은 플라스미드 DNA가 pore 에서 더 쉽게 통과해 효율이 높을 것 이다. 두번째로는 copy number 이다. Pks(-)는 high copy number이고 PACYC 184는 Pks(-)에 비해 low copy number 이기 때문에 투입량 또한 다르게 해주었지만, 그럼에도 불구하고 차이가 났을 것 이다.
3.Introduction
3-1) vector
vector 는 원하는 DNA의 단편을 숙주로 하는 세포에 도입해 증식시킬 때 이용되는 자가증식능력을 가진 DNA이다. 제한 효소에 의해 절단된 DNA 단편을 대부분의 경우 같은 제한 효소에 의해 매개자의 제한효소 절단점에 이어져 숙주세포로 운반된다. 따라서 vector의 필요조건에는
1 숙주세포에 효율적으로 도입하고 그 안에서 자가복제가 가능할 것
2 DNA의 단편을 연결하기 위해 몇가지 적당한 제한효소 절단부위를 이용할 수 있어야 할 것
3 DNA 단편과 매개체의 치환체가 숙주세포에 도입된 것을 나타내는 약제내성 등의 표지유전자를 가져야한다
Vector로서는 플라스미드나 바이러스 파지 등의 DNA를 사용하는 경우가 많기 때문에 숙주에 따라 구분하여 사용한다. 유전자 클로닝에는 대장균이나 효모계를 자주 이용하고, 각 pBR322나 YRP의 계열이 비슷한 많은 매개자가 개발되어있다. 치환 DNA 실험에서는 이러한 매개자는 필수적이다. 매개자에는 2종류의 숙주 모두에서 증식 할 수 있는 것도 있고, 대장균-효모 처럼 원핵생물과 진행생물 사이의 것 등도 작성하고 있다
식물세포를 숙주로 하는 경우의 매개자로는 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드나 꽃 양배추 모자이크 바이러스를 비롯한 식물 바이러스, 가동성 유전인자, 식물기원의 DNA등을 고려할 수 있는데, 특히 Ti 플라스미드, 꽃양배추 모자이크 바이러스 등을 많이 사용하고 있다.
3-2)플라스미드
플라스미드 plasmid 는 많은 세균세포에서 자가복제 self replicating의 염색체의 DNA를 포함하고 있다. 이 플라스미드 DNA는 닫힌 고리형 구조이며 이중가닥이고 염색체 DNA에 비해 매우 작다. 분자질량은 2*10^6 에서 2*10^7 달톤 정도로써 약 3000-30000 염기쌍 정도의 크기에 해당한다. 일반적으로 세균의 플라스미드는 종종 생물체에 보호형질 phenotype 을 부여하는 특수한 단백질의 유전정보가 포함되어 있다. 이러한 형질의 예로는 항생제의 생산이나 또는 독소와 항생제의 분해에 필요한 효소체계를 들 수 있다. 이러한 플라스미드를 이용하여 재조합 DNA ( recombinant DNA)의 제작, 즉 분자 클로닝 (molecular cloning)이 가능한데, 이는 한 종류의 세포나 생물체의 DNA 단편을 복제중에 있는 다른 종류의 세포의 공유결합에 의해 삽입되는 과정이다. 근본적으로 DNA의 어떤 조작도 선택되어 복사될 수 있다. 많은 수의 혼성 DNA hybrid DNA 사본이 수용체 세포의 자손에 의해 생산될 수 있다. 즉 DNA 분자가 cloning 된다. 만약 삽입된 DNA 단편이 상류의 promoter가 존재한다면 많은 수의 유전자 사본과 번역된 단백질 산물이 숙주세포 내에서 생산된다. 이러한 과정을 통해 의학 농학 그리고 기초과학에 있어서 가치가 있으면서도 생산이 까다로운 단백질을 대량생산 할 수 있게 되었다.
3-3)competent cell
E.Coli를 포함한 대부분의 박테리아는 일반적인 환경에서 극히 제한된 양의 DNA만을 받아들인다. 이러한 종류를 효과적으로 transformation 하기 위하여 박테리아는 DNA를 받아들이는 능력을 향상시키는 물리적, 화학적 처리를 하여 외부의 DNA가 잘 들어갈 수 있도록 만든 cell을 competent cell 이라고 한다. competent cell 의 작용 mechanism은 아직 자세히 알려진 바가 없지만, competent cell을 water bath에 42℃ 70~90초 정도 넣어두면 cell wall 이 느슨해진 상태로 되어 그 사이에 삽입하는 하는 gene을 포함한 vector가 들어가고 바로 얼음에 다시 넣을 때 cell wall이 수축하는 방식으로 이루어진다.
*competent cell 의 화학적 제조방법
1.LB-plate에서 자란 DH 5 알파 colony를 LB 배지 2ml에 접종한 후 밤새 키운다
2.위에서 키운 배양액의 1ml 를 100ml LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D600 이 0.4가 될 때 까지 37℃ shaking incubator에서 키운다
3. 배양액을 50ml comical tube에 넣고 얼음에 10분간 놓아둔다
4. 4℃에서 4500RPM으로 10분간 원심분리한다
5. 상등액을 제거한 수 미리 제거해둔 0.1M filtered cacl2 용액을 원래 1/2부피로 넣고 부유시킨다
6. 얼음에 15분에 놓아두었다가 다시 4℃에서 3000-4000 RPM으로 10분간 원심분리한다
7. 상등액을 버리고 처음의 1/10 부피의 filtered cacl2 용액으로 부유시킨다
8. 얼음에 30분간 놓아두었다가 미리차게 해준 micto tube 에 200ml 씩 분주하고 사용할 때 까지 deep freezer 에 보관한다.
4.Material & Methods
4-1-1 <competent cell 제조>
1) E. coli DH5a의 single colony를 2 mL LB medium에 접종
→ 37℃ overnight incubation (seed culture)
2) 100 mL LB medium에 seed culture 넣음
3) 20 min 간격으로 OD600 에서 흡광도 측정 (Blank: LB broth)
4) OD600 = 0.4 에 도달하면 재빨리 ice에 옮겨 20 min 방치
5) 차가운 centrifuge bottle에 culture를 넣고 4℃, 20 min, 5000 rpm으로
centrifuge → 조심스럽게 상등액 제거
6) cell pellet를 ice cold pure H2O 20 mL에 넣고 조심스럽게 부유
7) 4℃, 10 min, 5000 rpm으로 centrifuge → 상등액 제거
8) cell pellet을 ice cold 10% glycerol 20 mL에 부유
9) 4℃, 10 min, 5000 rpm으로 centrifuge → 상등액 제거
10) 상기 과정(8 & 9)을 반복
11) cell pellet을 ice cold 10% glycerol 1 mL에 부유
12) eppendorf tube에 40 uL씩 분주해서 -80℃ 보관
4-1-2 < Electro-transformation >
1) LB medium 1 mL을 eppendorf tube에 취하여 37℃ water bath에 방치
2) Electro-competent cell (40 ㎕)와 DNA 용액 혼합
→ ice에 1 min 방치
3) 냉각시킨 0.2 cm electoroporation cuvette에 DNA/cell mixture 넣음
4) Gene pulser 이용하여 transformation
capacitance 25 uF
voltage 2.5 kV
resistance 200 Ω
5) pulse 후 빨리 LB medium에 부유
→ 37℃ water bath에 1 hr 방치
6) 배양된 cell를 각 항생제를 함유한 LB plate에 도말
희석: 1 ㎕, 0.1 ㎕(x10-1), 0.01 ㎕(x10-2)
4-2 Material
생략
5. Results
사진 설명을 입력하세요.
<Table.1. Pks(-), PACYC 184 transformation 결과>
형질전환효율 (CFU/ug) = 형질전환 수 / DNA 농도 * DNA 사용량 을 이용해 효율을 구했다.
2조의 데이터를 예시로하면 Pks(-)= 1.83*10^6 = (206*10^4 + 15*10^15) / 193.9*5*10^-3
PACYC 184= 1.83*10^5 = {(213*10^3 + 19*10^4)/2 } / 10* 110* 10^-3 이다
Pks(-)의 농도는 193.9 ng/㎕l , 5㎕ 사용
PACYC 184 의 농도는 110ng/㎕l, 10㎕ 를 사용
15미만의 콜로니는 계산을 하지 않았습니다.
분자에 희석배수보다 10을 더 곱한 이유는 -2 라고 썼지만, 마지막에 1ml 중 100 ㎕ 만 도말했기 때문이고
분모에 *10^-3 은 ng 과 ㎕의 단위를 같게 해주기 위함이다.
6. Discussion
이번 실험의 목적은 E.coli 에 plasmid DNA인 Pks(-), PACYC 184 를 형질전환 시키는 것 이었다. 본조의 형질전환 수율은 Pks(-)=1.83*10^6 CFU/ug DNA ,PACYC184=1.83 *10^5 CFU/ug DNA 로 나왔다. 효율계산에 이용되는 CFU는 다음과 같은 원리에 의해 구할 수 있다. 플라스미드 DNA에는 ampicilin, chloramphenicel 항생제 내성 유전자가 있고, 그래서 정확하게 플라스미드가 들어갔다면 들어갔다면 ampicilin ,chloramphenicel 항생제에 내성이 있는 bacteria 가 되었을 것 이다. 그래서 각 항생제가 있는 배지에서 살아남은 bacteria 는 transformation 이 되었다고 생각 할 수 있어 그 CFU를 계산해서 효율을 구하는 것이다.
두 플라스미드의 효율값을 보면 4개조 평균적으로 Pks(-)가 PACYC 184보다 더 높은 것을 알 수 있다. 다시 말해 1ug plasmid DNA당 형질전환시킬 수 있는 bacteria 수가 Pks(-)가 더 많다는 의미로 해석된다. 실험과정에서 Pks(-)=5ul, PACYC 184= 10ul 로 투여량이 2배 차이남에도 불구하고 효율이 차이가 난다는 것을 두가지로 추측해보았다. 먼저 plasmid DNA의 크기가 pks(-)는 약 3.0kb의 크기를 가지고 있고 PACYC184는 약 4.2kb의 크기를 가진다. electroporation 시 크기가 작은 plasmid DNA가 전기충격으로 발생된 pore를 더 쉽게 통과할 수 있기 때문에 효율면에 있어서 높게 측정된다. 두번째로는 copy number 인데, pks(-)는 high copy number지만 PACYC184는 low copy number 이다. 이 이유로 실험과정에서 PACYC184를 더 넣어주었음에도 불구하고 차이가 생겼다고 추측한다.
7. Reference
1)David.P.clark 등 2명, 이명석 옮김, 알기 쉽고 재미있는 분자생물학, 2007, 라이프사이언스, pp89-92
2)RoDney Boyer, 조성희 외 엮음, 생화학의 이해 제3판, 2007, 월드사이언스,pp340-393
pks(-) 는 3.0kb 크기이고 PACYC184 는 4.2kb 의 크기를 가지고 있다
그리고 copy number가 pks는 크고 PACYC184는 작아서 일부로 pacyc는 양을 더 넣어주었다.
엠피실린 항생제 내성 유전자, 클로로암페니셀
암페니실린 클로암페니셀
ampicilin ,chloramphenicel