미생물학실험 레포트 (5) :Yogurt 제조 및 젖산균 생균수 측정

Abstract

본 실험은 요거트를 제조하고 젖산균의 생균수를 측정하는 실험이다. 시판중인 요거트를 streaking하여 관찰된 두 종류의 균을 gram staining하고 검경하였을 때 큰 colony로 배양된 균이 간균 형태의 Lactobacillus bulgaricus, 작은 colony로 배양된 균이 연쇄상구균인 Streptococcus thermophilus임을 확인할 수 있었다. 샘플 1과 3에서는 커드가 생성되었고, 샘플 2에서는 커드가 생성되지 않았다. 최종 요거트의 생균수는 BCP 배지에 배양하여 확인하였으며 pH indicator가 산에 의해 노란색으로 변하는 원리를 이용하였다. 생균수는 3.6×10⁸, 2.19×10⁸, 5.8×10⁸ (CFU/mL)이며 일반 요거트에 비해 비교적 신맛이 강하고, 고소한 냄새가 났다. 제조한 요거트의 pH는 1번과 3번은 3.86과 3.73으로 낮은 pH를 보였고 커드가 생성되지 않은 2번은 6.17으로 중성에 가까운 값을 보였다. 샘플 2에서 커드가 생성되지 않은 것은 균을 분리하는 과정에서 한가지 균만 분리 후 배양했을 것이라고 생각한다.

 

Introduction

(1) 요거트 젖산균

젖산균이라고도 한다. 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균의 총칭. “유산균”이라고 부르는 이름은 관용명이고 분류학적인 위치를 가리키는 것은 아니다. 산소가 적은 환경에서 잘 발육하여 각종 당으로부터 락트산을 생성한다. 산에 내성을 나타내는 것이 많고 영양 요구성은 매우 복잡하여 당류 이외에 많은 종류의 아미노산이나 비타민을 요구하며 균종, 균주에 따라 미량 영양소를 가하지 않으면 생육할 수 없는 것도 있다.

유산균 발효형식에 따라 정상(homo)유산발효와 이상(hetero)유산발효로 나뉜다. 유산균은 농산물이나 식품에서부터 사람이나 동물의 몸까지 자연계에 널리 분포하고 있으며 확실한 생육처를 알 수 없는 것도 있다. Lactococcus 속은 10℃에서 발육하지만 45℃에서는 발육하지 않고 최적온도가 30℃ 전후의 구균으로 정상발효를 한다. 유제품의 스타터(starter)로서 식품가공에 사용되는 균종이 많다. Pediococcus 속은 정상발효를 하는 구균으로 4련의 세포배열을 한다. 생육온도, 유산의 선광성 등에 의해 8종류의 균종으로 분류되어 있다. Pediococcus 속은 Leuconostoc 속과 함께 발효에 관련된 대부분의 균이 동물의 생체와는 관계가 적다. Leuconostoc 속은 이상발효하는 연쇄구균으로 당 분해, 성장, 생육 pH 등에 의해 4종류의 균종으로 분류되고 또한 Leuconostoc mesenterides는 3가지 아균종으로 분류된다. Lactobacillus 속은 정상발효와 이상발효를 하는 2종류로 대별되는데 생육온도, 당분해, 성장, 생성 유산의 선광성 등에 따라 55균종 11아균종으로 분류되어 있다. Lactobacillus 속은 대표적인 유산균으로서 각종 발효식품에 사용되고 또한 장관 상재 균총으로서 사람이나 동물의 건강과 중요한 관계가 있다. Bifidobacterium 속과 L. mesenterides는 이상발효를 하는 편성혐기성 Gram양성 간균으로서 주로 유산과 초산을 최종산물로 생산한다.

 

(2) Natural fermentation, back slopping, pure culture란?

① Natural fermentation

자연 환경에서 인위적으로 가온함이 없이 발효 숙성시키는 양조방식이다. 효소작용과 미생물의 발효작용이 자연히 진행하고 발효를 위한 특별한 시설이 필요하지 않고 적당한 관리로 제품이 얻어지는 이점이 있지만 그 해의 날씨에 좌우된다는 결점도 있다.

발효유의 기원은 유목민들이 신선한 우유를 가죽부대로 만든 용기에 넣어 이동하던 중 우유가 사막의 더운 기후에서 우유 속의 존재하는 유산균에 의해서 자연 발효되어 우유가 순두부 같이 엉기게 되었는데 이것이 자연적인 발효유의 탄생이라고 본다. 유럽이나 북미의 요구르트는 과실이 첨가된 떠먹는 호상 요구르트가 대부분이지만 한국과 일본 등 동남아 지역에서는 과즙을 넣어 마시는 형태의 액상 요구르트가 많이 소비되며, 최근에는 유럽과 북지 지역 등에서도 액상 요구르트 판매가 늘고있는 추세다.

② Back slopping

이 방법에서는 성공적으로 발효된 몇몇 생성물들이 starting material에 추가되고, 이전 생성물로부터 미생물들의 성장이 용이해지도록 상황이 준비된다. 이 방식은 작은 범위를 차지하는 많은 전통식품에서 여전히 시행되고 있다. 미생물학적 특징이 변화하기 때문에 오랫동안 생산물 고유의 특징을 유지하기는 어렵다. 생산물의 부패나 식중독에 걸릴 확률도 매우 높다.

원재료의 자연발효 또는 back slopping의 접종을 통한 전통적인 발효법은 단점을 갖고 있다. 발효식품이 이미 부패하였거나 해로운 세균을 포함하고 있을 가능성이 높고, 품질을 일관되게 유지하는 것이 힘들다는 점이다. 반면 그 발효 특성이 이미 알려진 starter culture를 사용하는 현대적 발효 기법의 경우, 부패가 적고 상대적으로 더욱 안전한 품질을 지닌 제품을 일관되게 생산할 수 있다. 그러나 전통적 발효법의 주된 장점은 효율적으로 통제되는 현대적 발효 공정에서는 재현하기 힘든 독특한 향미를 지닌 제품을 생산할 수 있다는 점이며, 아직도 그 맛을 잊지 못하는 소비자들은 전통적으로 발효한 식품을 선호하기도 한다. 또한 케피어 발효유를 만들 때 사용되는 케피어 그레인의 경우처럼 어떤 종류의 자연적인 starter들은 매우 안정적이며, 아직은 식품 발효에서 여전히 전통적 방법이 사용되기도 한다.

③ Pure culture(Starter culture)

스타터는 각종의 발효유제품 제조시 원료유의 젖산발효를 일으키기 위하여 사용되는 젖산균(lactic acid bacteria)의 종균을 말한다. 발효유제품 제조에 이용되는 젖산균 스타터는 그 용도와 형태에 따라 액체스타터(liquid starter), 제조용 농축냉동스타터(irect-vat-set starter:DVS starter), 본배양용 농축냉동스타터(ready-set starter), 그리고 냉동건조스타터(freeze- dried starter)가 있다.

자연 상태에서 존재하는 오염 미생물을 통한 발효 과정은 점차 개량되었다. 원하는 특성을 지닐 수 있도록 선행 배양된 back slopping을 원재료에 접종하는 방식을 사용하여 좀 더 안정적인 발효가 이루어질 수 있게 함으로써 식품의 질을 좀 더 오랜 기간 보존하고 식품의 다양성을 증가시킬 수 있게 되었다. 이를 위해서 발효에 사용되는 미생물들을 분리, 동정하고 그들 균주로 인한 발효의 형태를 규명하였는데, 실험실 내에서 일반적으로 초기 배양체로 아려진 미생물의 순수 배양물을 원재료에 접종하여 발효하면 back slopping을 이용하는 경우보다 안정적이고 일관성 있는 발효 제품을 얻을 수 있다.

Starter culture의 사용은 오늘날 서양에서 이루어지고 있는 대부분의 식품 발효의 기초를 이루고 있으며, 예전부터 전해져 오던 발효의 기법은 보다 과학적인 대규모 산업 공정에 맞춰 조정될 수 있도록 변형되어 왔다.

 

 

Materials & Methods

(1) Materials

- Streaking에는 MRS agar, 알코올램프, 백금이, 요거트 시료가 필요하다.

- 계대배양에는 Test tube, MRS broth, 백금이, streaking한 petri dish, 알코올램프와 vortex mixer이 필요하다.

- Gram staining에는 백금이, slide glass, 알코올램프, 증류수, crystal violet, Iodine 시약, 95% ethanol, Safranin O, cover glass, 현미경과 immersion oil이 필요하다.

- Yogurt 제조에는 test tube, centrifuge, vortex mixer, falcon tube, peptone water, 증류수, 우유가 필요하다.

- 젖산균 생균수 측정에는 제조한 요거트, peptone water, BCP agar, spreader, 알코올램프와 vortex mixer가 필요하다.

- 요거트 pH 측정에는 pH standard buffer(4.01, 7.00, 10.01), pH probe, 94.5% alcohol, 증류수가 필요하다.

 

(2) Methods

MRS agar에 요거트를 streaking한다. 이틀간 37℃에서 배양한다.

계대배양시에 falcon tube에 MRS broth 10mL를 담고 요거트를 streaking한 plate에서 큰 colony와 작은 colony를 각각 1백금이 취하여 MRS broth에 풀어 넣고 vortexing 후 37℃에서 24시간 동안 배양한다.

이후 Gram staining을 통한 colony 검경을 할 때 요거트를 streaking한 plate에서 큰 colony와 작은 colony를 각각 취해 slide glass에 도말한 후 물을 이용해서 다시 한 번 넓게 도말한다. 이후 알코올램프 위에서 살짝 건조시켜 고정한 후 crystal violet 염색약을 2~3방울 떨어뜨린 뒤 60초간 염색한 후 slide glass 뒷면에 물이 흐르도록 수세하고 iodine 시약을 2~3방울 떨어뜨린 뒤 60초간 기다린 후 수세한다. 다음으로 95% ethanol을 2~3방울 떨어뜨린 뒤 20초간 기다린 후에 수세하고 마지막으로 safranin O 시약을 2~3방울 떨어뜨린 뒤 20초 후에 수세한다. 다음으로 주위의 물기를 잘 제거한 뒤 cover glass를 올리고 유침으로 1000배율에서 검경한다.

다음으로 yogurt를 제조할 때 계대배양한 균 배양액을 8500rpm, 4℃, 20min 원심분리한다. 이후 균만 남아있는 falcon tube에 peptone water를 넣어 vortexing 후에 원심분리를 하고 peptone water를 제거해 washing 한다. falcon tube에 우유를 10mL 넣고 vortexing 후에 다시 우유 안에 넣어준다. 접종한 우유를 43℃에서 24h 동안 발효한다.

다음으로 요거트 젖산균 생균수를 측정할 때 자신이 제조한 요거트에서 1mL를 취해 9mL의 peptone water에 적절히 희석, 균질화 시켜 시료로 이용한다. (10^-7까지 희석했다.) 또한 serial dilution을 하여 10-4~10-7으로 희석한 후 BCP 배지에 0.1mL씩 spreading한다. 이후 37℃에서 24시간 배양 후 colony 주위에 노란색으로 변한 것만을 계수한다.

마지막으로 요거트의 pH를 측정할 때 pH standard buffer(4.01, 7.00, 10.01)을 이용하여 calibration curve를 설정한다. pH probe는 사용 전 후로 94.5% alcohol에서 증류수 순서로 세척 후 부드럽게 물기를 닦아준다. 제조한 요거트를 falcon tube에 적당량 넣어 pH probe를 시료에 담근 뒤 measure 후 결과값을 측정한다.

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Results & Discussion

본 실험에서 요거트를 streaking 하였을 때 크기가 크고 작은 두 가지 형태의 colony가 관찰되었다. Figure 1에서는 streaking 후 37℃에서 배양한 사진이며, 시료가 희석되어 도말 끝부분에서 큰 콜로니와 작은 콜로니가 분리되어 나타난 것을 확인할 수 있다. 이를 gram staining 했을 때 관찰된 모습은 다음과 같다.

Figure 2에서는 작은 콜로니의 현미경 관찰 모습으로 보라색으로 염색된 구균이 관찰된다. Figure 3에서는 큰 콜로니의 현미경 관찰 모습으로 보라색의 간균이 관찰된다. 따라서 크기가 컸던 colony의 균은 Lactobacillus bulgaricus이며 크기가 작은 colony의 균은 Streptococcus thermophilus임을 알 수 있다. 한편, 작은 콜로니는 Streptococcus thermophilus으로 연쇄상의 구균이지만, 본 실험에서는 연쇄상의 모습을 확인할 수는 없었다.

두 균을 분리해 계대배양 후 원심분리해 우유에 접종했다. 계대배양 모습에서 2번 샘플의 분리가 완벽하게 되지 않아 작은 콜로니를 배양된 튜브에서 큰 콜로니와 같게 자라난 것을 확인할 수 있었다. 43℃에서 배양 후 요거트를 확인했을 때 2번 샘플은 커드를 형성하지 않고 액체 상태인 것을 확인할 수 있었다. 이는 계대배양 과정에서 실수가 있었다고 추정되는데, 작은 콜로니를 취하지 않고, 큰 콜로니만 배양했기 때문일 것이라고 예상한다. 1번과 3번 요거트는 커드가 형성된 것을 확인할 수 있었고, 향이 고소했다. 맛은 신맛이 강하게 나 pH가 낮을 것이라 생각했다.

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두 균을 우유에 넣어 요거트를 제조한 후에 요거트를 10-4~10-7까지 serial dilution을 하고 BCP agar에 spreading하였다. 이 배지에서는 젖산균이 당을 분해하여 생산하는 lactic acid에 의해 pH indicator인 bromocresol purple이 보라색에서 노란색으로 바뀌게 되는데 이런 특징을 이용하여 젖산균의 생균수를 측정하였다.

생균수를 측정할 때 사용한 colony의 계수법은 30~300의 유효한 값만을 계수하여 생균수를 측정하였다. 유효 콜로니는 2번 샘플 10⁻⁵에서 219개, 1,2,3 샘플 10⁻⁶에서 36, 25, 58개가 나왔다. 나머지 희석배수에서는 300이 넘거나, 30미만이었다.

직접 제조한 요거트의 생균수는 다음과 같다.

생균수(CFU/g) = colony 수의 평균 / 희석배수 × 접종량(mL)

1) 생균수(CFU/mL) = 36/ [(10^-6) × 0.1mL]= 3.6×10⁸ (CFU/mL)

2) 생균수(CFU/mL) = 219/ [(10^-5) × 0.1mL] = 2.19×10⁸ (CFU/mL)

3) 생균수(CFU/mL) = 58/ [(10^-6) × 0.1mL]= 5.8×10⁸ (CFU/mL)

생균수 계산 결과 샘플1과 3은 3.6×10⁸ 과 5.8×10⁸(CFU/mL)로 비교적 높게 나왔고, 커드를 생성하지 않은 샘플 2의 생균수는 2.19×10⁸ (CFU/mL)로 특히 적은 생균수를 포함하고 있는 것을 알수 있었는데, 이는 균이 1종류만 들어갔다고 예상한 것과 일치하는 결과이다.

본 조에서 만든 요거트의 pH 값은 table 1와 같다.

1번과 3번은 3.86과 3.73으로 낮은 pH를 보였고 커드가 생성되지 않은 2번은 6.17으로 중성에 가까운 값을 보였다. 일반적으로 요거트의 pH는 3.7~4.3 인데, 제조한 요거트는 보다 낮은 3.7~3.8으로 결과가 나왔다. 이는 일반 시중 요거트보다 오래 발효시켰기 때문이라고 생각한다. 반면, 샘플 2번은 6.2로 중성에 가까운 pH를 보였는데, 이 때문에 커드가 생성되지 않았다고 생각한다. 커드가 생성되는 이유는 우유 속에서 마이셀 구조를 하고 있던 카제인이 pH가 낮아짐으로 단백질의 등전점에 도달하면 마이셀 구조가 풀려 겔을 형성하는 것인데, 2번 샘플은 균이 충분히 자라지 않아 젖산의 생성량이 적어 pH가 커드를 생성할만큼 낮지 못했기 때문이다.

[논문] 한 논문에서는 그루지아의 전통 발효유로부터 유산 생성과 항균성이 우수한 3주의 균주를 최종 분리하여 선발하고 각각 Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus로 동정하였다. 이들 유산균을 starter로 요구르트를 제조하여 이화학적 특성을 조사한 결과 pH는 4.0~4.5의 범위로 나타났으며 L. acidophilus의 균주의 pH 값이 가장 낮았으며 산-염기에 대해 완충능이 가장 높게 관찰되었다. 또한 in vitro에서의 콜레스테롤 저하 능력을 측정하였을 때 L. acidophilus가 약 35%로 가장 높은 저하 정도를 보였으며 L. bulgaricus와 S. thermophilus는 각각 32%, 24%의 저하능력을 보였다. 이를 통해 발효유를 제조하는 과정에서 균주의 추가적인 선택으로 인해 신체에 기능성을 줄 수 있는 발효유를 제조할 수 있음을 확인하였다.

 

Homework

(1) Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus의 특성(+ 요거트에서 발표 특성?, 발효 온도에 따른 생장의 차이)

① Streptococcus thermophilus

Streptococcus 속중 오직 한 종류, Streptococcus thermophilus만이 유제품 발효에 사용된다. Streptococcus thermophilus는 그람양성균으로, 둥그스름한 모양을 가지고 지름은 0.7~0.9이며, 구형의 균이 사슬모양으로 이어져 있다. 이 균은 37-40℃에서 잘 자라고 52℃에서도 자랄 수 있다. 이 균은 fermentative anaerobe이며 glucose broth에서 pH를 4.0까지 감소하게 할 수 있고 젖산을 생성할 수 있다. fructose, mannose, lactose를 발효하지만 galactose와 sucrose는 일반적으로 발효하지 않는다. 이 균은 60℃에서 약 30분간 생존할 수 있다. 이 균들이 우유 안에서 발견됨에도 원래의 서식장소는 아직 알려지지 않았다. 유산생성능력이 매우 뛰어나며, 항생제에 민감한 특징을 가지고 있다.

② Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

Lactobacillus 속은 당류를 발효하여 에너지를 획득하여 다량의 유산을 생성하는 세균으로 형태적으로는 Gram 양성 무포자 간균으로 다형성을 나타내고, 크기는 0.5~0.9×1~11μm로 단간균에서 장간균의 여러 형태를 나타내며, coryne형을 나타내는 균종도 있다. 균의 배열은 단재, 이연쇄, 단연쇄, 단붕상이 있다. 대부분은 운동성이 없고, 보통은 catalase 음성이다. 본 속은 산소가 적은 환경에서 즐겨 발육하며 각종의 당에서 유산을 생성한다.

Lactobacillus bulgaricus로 알려진 락토바실러스 델브루에키이 서브스피시즈 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)는 요구르트에서 발견되는 여러 가지 균 중의 하나로서 유제품 제조에 있어서는 매우 중요한 균이다.

1905년 불가리아 의사인 스타먼 그리고로브(Stamen Grigorov)에 의해 처음 분리되어 불가리아로 명명되었다. 불가리아 우유는 Lactobacillus bulgaricus로 만든 불가리아의 전통 우유 제품이다. Lactobacillus bulgaricus는 혐기성으로 운동성과 젤라틴 액화력이 없는 것이 특징이다. 이 균의 생육 적정 온도는 40~50℃로서 우유를 37℃에서 응고시키지만 카세인(casein)은 분해하지 못한다. 그러나 젖산균 중에 산의 생성이 가장 빠르고 53℃에서도 생육한다. 특히 글루코스, 젖당, 갈락토스 등을 잘 발효하며, 2.7~3.7%의 젖산을 생산한다. 우유를 원료로 한 젖산 음료 및 젖산 제조, 정장제, 피혁 탈석회제 등으로 이용되고 있다.

 

효과적으로 성장하기 위하여 상대적으로 낮은 pH(약 5.4~4.6)를 필요로 하기 때문에 내산성 또는 산호성으로 간주된다. Streptococcus thermophilus에 비해 산 생성정도가 더 크다. 이 균은 우유를 먹이로 하여 젖산을 생성하는데, 특히 유당의 생성을 줄여 유당 불내증 환자에게 도움이 된다. 요구르트의 주요 향미성분은 아세트알데하이드, 아세톤, 아세토인, 다이아세틸 등과 같은 카보닐 화합물이며 이 중에서 가장 중요한 것은 아세트알데하이드로서, 우유를 발효시키는 동안에 Lactobacillus bulgaricus에 의해 아세트알데하이드가 생산된다.

 

요거트의 주요 flavor 구성성분은 몇몇 diacetyl(0.5 ppm)과 acetaldehyde (25 ppm)과 acetate이다. Acetaldehyde는 두 가지 방법으로 생성된다. Streptococcus 속에서는 pyruvate를 매개로 하여 glucose로부터 생성된다. Lactobacillus 속에서는 threonine로부터 생성된다. 이러한 mechanism의 차이에 의해 flavor를 생성하는 정도가 달라진다.

 

(2) Symbiotic of yogurt (Symbiotic mechanism)

yogurt의 발효는 서로 성장을 촉진하는 두 가지 미생물 사이의 상호 작용을 보여준다. Streptococcus thermophilus가 발효를 시작하면 이산화탄소와 포름산(formic acid)가 생성되어 pH가 낮아지고 Lactobacillus bulgaricus의 성장이 촉진된다. L. bulgaricus는 단백질 분해효소(proteinase) 활성을 가지고 있어서 작은 펩타이드와 아미노산을 생산하게 되는데 이것이 S. thermophilus의 성장을 촉진한다. 이러한 상호 작용은 두 미생물이 더 빨리 성장하여 보다 빠르게 발효할 수 있도록 촉진하는 역할을 하며 각각의 미생물을 발효시켰을 경우보다 유산 및 향미 성분(flavor compound)의 생산이 더욱 증가한다.

발효가 끝난 후 최종 생산물의 pH는 대략 3.7~4.3 정도이고, 유산의 함량은 0.8~1.8% 정도, 가장 주된 향미 성분인 아세트알데히드의 함량을 20~40ppm이며, 그 외에 또 다른 향미 성분인 디아세틸(diacetyl) 및 케톤(ketone) 화합물, 아세트산을 소량 포함하고 있다.

(3) Probiotics, Prebiotics, Synbiotics란 무엇인지 각각 조사(Beneficial effects of probiotics 포함)

① Probiotics

인간이나 동물 등 숙주의 건강에 유익한 효과를 나타내는 미생물 또는 그 성분인데 probiotics라고도 하며 이는 “for life”라는 뜻을 갖고 있다. 이 용어의 개념은 노벨상 수상자인 메치니코프(Élie Metchnikoff 1845-1916)가 최초로 사용하였다. 메치니코프 박사는 요구르트를 소비하는 불가리아 농민들이 더 오래 사는 것을 관찰한 뒤 1907 년에 "음식에 의해 장내미생물 군집이 크게 변하며, 유용한 미생물을 섭취하여 유해한 미생물을 대체할 수 있다"고 제안했다.

장내에서 정상 균총으로 나타나는 유산균이나 비피더스균 등을 포함한다. 프로바이오틱스는 젖산으로 다른 탄수화물과 설탕으로 전환할 수 있기 때문에 오랫동안 식품산업에서 사용되어져 왔다. 프로바이오틱스는 요구르트와 같은 발효 유제품의 신맛을 제공할 뿐만 아니라, 성장을 위해 손상된 조직을 재건하기도 하며 pH를 낮추어 부식방지제로서 작용한다. 프로바이오틱스의 가장 흔한 형태는 발효된 유제품과 프로바이오틱스가 강화된 식품이며, Kefir (우유 발효 음료), 요구르트, Sauerkraut (발효된 독일식 김치), 한국김치 등의 젖산균도 프로바이오틱스의 건강효과와 유사한 것으로 나타났다.

프로바이오틱스는 유당불내증을 개선하고 결장암을 예방하며 콜레스테롤 및 혈압을 낮춘다. 그리고 면역기능 개선, 감염예방, 무기물의 흡수개량, 스트레스로 인한 유해한 세균의 성장 방지, 과민성대장증후군과 결장염 개선 등의 역할을 한다. 또한 면역시스템을 강하게 하며, 캔디다증과 관련된 장의 치료와 항생제로서 권고되어 왔다. 프로바이오틱스는 항생제 사용 또는 약, 과잉의 알콜, 스트레스, 질병, 독성물질에 노출, 항균비누의 사용 등의 상황에 우리 몸이 균형을 유지할 수 있도록 하는 역할을 한다. 또한 우리의 건강을 저해하고 유해한 경쟁자가 성장하지 못하도록 활동한다. 식사에서 프로바이오틱스 음식의 상당 비율을 포함시키는 것은 건강한 프로바이오틱스 세균군의 지원을 통하여 바람직한 건강 이익 달성을 지속적으로 약속받을 수 있기 때문이라는 보고가 있었다.

대표적인 균주로는 락토비실러스 계열 과 비피도박테리움 계열이 있다.

락토비실러스 계열

- 락토비실러스 아시도필루스 : 과산화수소와 젖산분비, 천연항생물질(Acidophilin) 등을 형성하여 여성의 질내 ph 유지 및 칸디다와 유해균 억제에 도움이 되는 균주다.

- 락토바실러스 람노서스 : 현재 면역에 관해 가장 많은 연구 논문이 존재하고 면역조절 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다.

-그밖에 락토바실러스 플라타늄, 불카리쿠스, 카제이 등 많은 균주들이 있다

비피도박테리움 계열

- 비피도박테리움 락티스 : 대장에 주로 서식하며, 위산과 담즙에도 잘 파괴 되지 않는 균주인데, 면역세포의 활성과 항생제 관련 설사에도 도움을 주고 람노서스와 함께 면역에 많은 연구가 진행중인 균이다.

- 이밖에 비피도박테리움 인판티스, 비피덤, 브레브 등 다양한 균주가 존재한다.

② Prebiotics

대장 내 유용 미생물에 의해 이용되어 미생물의 생육이나 활성을 촉진함으로써 숙주 건강에 좋은 효과를 나타내게 하는 비소화성 식품성분. 식품성분이 프리바이오틱스의 조건을 갖추려면 위장관의 상부에서 소화 또는 흡수되지 않아야 하고 장내 미생물에 의해 분해되는 물질이며 대장 내의 미생물 중 비피도박테리아와 같은 유용 세균을 선택적으로 활성화시키고 병원균 등의 유해균은 억제할 수 있어야 한다. 프리바이오틱스의 예로는 라피노오스, 대두올리고당, 프럭토올리고당, 갈락토올리고당 등의 올리고당류와 기타 락툴로오스(lactulose), 락티톨(lac- titol), 자일리톨(xylitol) 등이 있다. 또한, 모유에 갈락토올리고당과 유사한 올리고당이 많이 들어 있어 장내 비피더스균의 숫자를 증가시키며 어린이의 면역력을 강화시킨다.

③ Synbiotics

활생균(프로바이오틱스)과 프리바이오틱스의 혼합물. 활생균과 그 영양원이 되는 프리바이오틱스가 단일제제에 혼합되어 있으므로 섭취하였을 경우 대장 내에 유용세균이 잘 정착되어 활생효과가 쉽게 나타날 것으로 기대할 수 있다. 유럽에서는 사용되고 있는 유용 유산균의 증식에 효과가 있는 올리고당 등의 물질을 첨가한 요구르트를 ‘synbiotic yogurt’라고 부르고 있다.

 

(4) Lactose intolerance(유당불내증)은 무엇인가?

lactose intolerance는 젖당을 분해하는 효소인 락타아제(lactase)의 결여 및 부족으로 인하여 발생하는 질병으로, 소장으로 들어온 젖당의 분해가 일어나지 못할 때 나타나는 증상이다. 소장의 유당분해효소 결핍 때문에 유당의 분해와 흡수가 충분히 이루어지지 않아 대장 내에서 유당은 수분을 흡인함과 동시에 대장의 세균성 유당분해에 의해 포도당 그리고 유산이 되며 이 때문에 대장의 연동운동이 자극되어 설사, 가스에 의한 장 팽만시에 복통 등의 증상을 일이키는 증상이다.

유당불내증은 체내에서 락타아제의 생산이 일어나지 않는 선천적인 원인과, 성장과정에서 락타아제의 생성 및 분비량의 감소로 젖당 소화에 장애가 나타나는 후천적인 원인이 발병의 원인으로 보고되어 있다. 선천적인 경우 상염색체 변이를 통하여 우성으로 유전되어 나타나며, 매우 희귀한 질환 중에 하나로 남녀에서 발병 비율이 동일하게 나타난다. 후천적인 유당불내증은 영아기 이후부터 성인에 이르기까지 광범위하게 일어나며 개인별 증상의 차이가 크게 나타난다.

질병의 발병 시에 동반 되는 증상에는 복부 통증이 일반적이며, 구역질, 복부 팽만, 설사 등이 동반된다. 유당이 첨가되어 있는 유제품 섭취 후 30분에서 2시간 사이에 증상이 나타나며, 증상이 나타나는 속도는 락타아제의 분비 정도에 비례하여 개인에 따라 다르게 나타난다. 젖당못견딤증은 인종에 따라 큰 발병률 차이를 보이는데, 주로 아시아인과 아프리카인에게서 흔하게 나타난다.

우유가 소장에서 소화되지 못한 채 대장으로 이동하기 때문에, 대장으로 이동한 다량의 젖당 분자는 삼투현상에 의해 다량의 물 분자들을 끌어당기고, 일부 젖당은 대장의 미생물들에 의해서 발효되어 복부의 발효가스와 산을 생성하면서, 다량의 물과 가스로 인한 복통과 설사가 유발된다. 복통 설사는 일시적이며, 젖당을 포한한 배설물이 제거되면 즉시 회복된다. 젖당이 함유된 음식물을 피하면, 큰 문제없이 생활할 수 있지만 우유에 있는 다양한 영양소들이 결핍될 가능성이 있으며, 골다공증, 고혈압, 결장암의 발병률이 증가할 수 있기 때문에 영양소 섭취에 신경을 써야한다.

유당불내증은 발생 시기와 원인에 따라 4가지 형태로 구분되며 모두 락타아제의 생성 및 분비 이상과 관련이 있다.

- Primary lactase deficiency: 대부분의 유당불내증이 해당되며, 성장기 동안 락타아제의 생산 및 분비 저하로 인해 젖당 소화가 원활하지 않은 경우이다. 인종에 따라 발생률 차이가 큰데, 특히 대부분의 아시아인과 아프리카인에게서 흔하게 발생한다.

- Developmental lactase deficiency: 출산 직후의 태아에게서 짧은 기간 동안 젖당에 대한 저항성이 발생하는 경우를 의미한다. 증상이 나타난 후 일정 시간이 지나면 자연적으로 증상이 회복되어 비정상적인 젖당 분해로 인한 문제 발생이 크지 않다.

- Congenital lactase deficiency: 락타아제를 암호화하고 있는 유전자 결함에 의한 희귀 유전질환으로 락타아제 결핍에 의해 젖당못견딤증이 나타난다.

- Secondary lactase deficiency lactase: 락타아제를 분비하는 소장 세포가 미생물 및 외부 세균의 감염에 의해 손상을 받아 소실될 때 발생하는 특수한 형태의 유당불내증이다.

 

(5) BCP 배지의 조성 및 원리

BCP 배지의 조성(G/L)은 peptone water 5.0, Yeast Extract 2.5, Dextrose 1.0, L-Cysteine 0.1, Bromocresol Purple 0.04, Agar 15.0, Tween 80(Polysorbate 80) 1.0 이며 최종 pH는 6.8+- 0.2 at 25℃이다.

BCP agar에 첨가된 BCP는 Bromocresol Purple이라는 성분의 약자이다. 이 성분은 산, 염기 지시약으로 사용된다. 이 성분이 BCP agar가 differenial medium의 성격을 가지게 해준다. 변색역은 pH 5.2~6.8이다. BCP는 산성에서는 노란색, 염기성에서는 보라색을 띠는 성질이 있어서 Lactose가 존재하면 노란색을 띠고 Lactose가 존재하지 않으면 보라색을 띤다.

Polysorbate 80과 L-Cysteine 첨가물은 이 배지에서 유산균의 성장을 강화시켰다. peptone 은 질소와 탄소의 화합물을 공급한다. Yeast Extract은 비타민 B 복합체를 제공하고 Dextrose는 발효 가능한 탄수화물 및 에너지원이다.

 

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