미생물학실험 레포트 (4) : 곰팡이의 현미경 관찰, Microscopic observation of mold

1. Abstract

본 실험은 곰팡이가 핀 시료(고추장)에서 직접 곰팡이를 분리해 YM agar에 배양해보고 현미경으로 검경하는 실험이다. 우선 cover glass에 malt extract agar를 부어 굳히고 칼날로 잘라 정사각형 모양으로 만든다. 이후 시료에서 채취한 곰팡이를 접종하여 hollow glass 위에 증류수를 떨어뜨린 뒤 주변에 vaseline을 바른 후 뒤집어 배양한다. 이후 현미경으로 검경한다. 400배율에서 septum의 여부와 포자의 모습을 간략하게 관찰할 수 있었다. 검경 결과 곰팡이는 격벽이 없었고, 흩어져있는 포자는 확인 할 수 있었지만 균사체에 연결되어 있는 유선포자와 무성포자의 모습은 확인할 수 없었다. 이를 통해서 본 실험에서 사용된 곰팡이는 Rhizopus속임을 확인할 수 있었고, 곰팡이는 발효와 같은 유익하게 사용될 수 있으며 부패를 유발할 수도 있음을 확인할 수 있었다.

 

2. Introduction

(1) 곰팡이(Mold)

균류는 조균류, 담자균류, 불완전균류 등과 같이 분류한다. 이 중에서 버섯을 형성하는 것은 자낭균류의 일부와 담자균류가 대부분이므로 나머지는 모두 곰팡이류로 다루게 된다. 곰팡이는 분류학상 진균류에 속하며, 육안으로 보기에는 착색된 가루모양의 포자(spore)를 갖는 깃털모양을 하고 있다. 여러 개의 분지된 실모양의 관에 다핵의 세포질이 들어 있는 구조로 되었는데, 이것을 균사(hyphae)라 하고, 균사의 집합체를 균사체(mycelium)라고 한다. 진균류 중 균사를 형성하고 생활하는 것을 가리켜서 사상균이라고도 부른다.

균사체에서 갈라진 가지가 위로 뻗고, 그 끝에 포자를 착생하는 것을 자실체(fruiting body)라고 부르며, 그물과 같이 얽힌 균사체와 자실체 전체를 균총(colony, mycerial mat)이라고 한다. 곰팡이에 있어서 균사체는 영양기관이고, 자실체는 번식기관이다.

곰팡이의 균사는 영양분의 섭취와 발육을 담당하는 기관이다. 그것이 자라는 형태에 따라 기질 속으로 침투해 들어가며 자라는 것을 기중균사(submerged hyphae)라 부르고, 균사라 기질표면에 밀착하여 뻗어가는 것을 영양균사(vegetative hyphae)라고 한다. 자실체는 보통 기질의 표면에서 곧게 공기 중으로 뻗어 자란다. 또한 균사 끝에 번식기관을 형성하지 않고 기질의 표면에 곧게 공중으로 뻗는 것을 기균사(aerial hyphae)라 한다.

균사는 발육함에 따라 분지되며, 격벽 또는 격막이라고 하는 칸막이가 생기는 것도 있고 생기지 않는 것도 있는데, 원어로는 septum이라고 한다. 이러한 격벽의 유무는 진균류의 분류에 중요한 지표가 된다.

털곰팡이과(mucoraceae)에 속하는 곰팡이의 균사에는 격벽이 없고, 그 속에 많은 핵을 가진 다핵체적 세포(coenocytic cell)로 되어 있다. 그러나 국균과(aspergillaceae)와 불완전균(fungi imperfecti)에 속하는 곰팡이는 균사에 격벽이 있고, 그 격벽에 작은 구멍이 있어 세포질이 서로 연결된다.

곰팡이의 번식법으로는 주로 포자에 의해 번식하지만 절단된 균사에 의해서도 번식이 가능하다. 포자는 적당한 환경에서 발아하여 균사가 되어 균사체를 형성하고 포자를 양생한다. 포자를 형성하는 기관이 자실체이고 종류에 따라 특징적인 모양을 가진다. 대개는 균사의 선단에서 형성되나 간혹 분기에서 형성되기도 한다.

또한 유성적으로 포자가 생성될 때 이를 유성포자라 하고 무성적으로 포자가 생성될 때를 무성포자라고 한다. 즉 유성 및 무성으로 포자를 형성하는 곰팡이를 완전균류, 무성포자만 형성하여 증식하는 곰팡이를 불완전균류라고 한다.

유성생식은 두 개의 세포핵이 서로 융합하여 다시 감수분열한 핵이 중심이 되어 그 결과로 생성되는 포자를 유성생식이라 한다. 유성포자에는 난포자(oospore), 접합포자(zygospore), 담자포자(basidiospore), 자낭포자(asopore)의 네 종이 있다.

무성생식은 세포핵의 융합이 없이 단지 분열에만 의해 무성적으로 생긴 포자를 무성생식이라 하며 곰팡이의 균총 색깔은 거의 무성포자의 색에 의한다. 종류로는 포자낭포자(sporangiospore), 분생자(conidia), 분절포자(arthrospore), 후막포자(chlamydospore)가 있다.

 

곰팡이는 식품의 부패의 원인이 되기도 하지만 식품에 이용되기도 한다. 특히 곰팡이는 발효에 유용하게 활용되어 우리나라에서 장류를 만들거나 탁주와 같은 주류를 발효시킬 때 이용된다.

누룩곰팡이는 콩을 발효시켜 된장, 간장을 만드는데 쓰이며 막걸리를 만드는 데에도 쓰인다. 일본에서도 간장, 미소(일본 된장), 사케(일본 술), 가쓰오부시 등을 만들 때 사용된다. 살라미 같은 일부 소시지에도 풍미를 증진시키기 위해 곰팡이가 사용된다. 또한 치즈 제조에도 사용되는데 Penicillium camemberti와 Penicillium roqueforti는 그 종류이다.

특히 누룩곰팡이가 식품(막걸리나 사케)을 발효할 때 사용되는 이유는 효모에게 당분을 공급하기 위함인데, 누룩곰팡이는 전분 분해 효소인 amylase로 곡물의 전분을 분해할 수 있고, 그에 따른 부산물을 내놓는데, 그것이 바로 당분이다. 즉, 곡물에 누룩곰팡이를 넣으면 전분이 분해되어 당분이 생기고, 이 당분을 효모가 분해하면 알코올이 만들어진다.

 

(2) YM agar

YM Agar와 Broth는 선택적 배지로 효모, 곰팡이 또는 acid-tolerant 나 acidophilic organisms 배양에 유용한 배지이다. 대부분의 박테리아의 성장을 억제한다. 맥아 추출물의 변형된 배지로 효모 추출물 및 펩톤, Dextrose등이 첨가된다.

이름의 'YM'은 출처에 따라 '효모와 곰팡이'또는 '효모 추출물-몰트 추출물'을 의미한다.

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3. Materials & Methods

Materials

본 실험에서는 곰팡이가 핀 시료(고추장), cover glass, melted YM agar, 멸균된 칼날, 알코올램프, 백금구, hollow glass, vaseline, 증류수, 현미경이 필요하다.

Methods

살균된 cover glass에 YM agar를 부은 뒤 굳힌다. 그리고 멸균된 칼날을 이용해 배지를 정사각형 모양으로 잘라 가운데 부분만 남도록 한다. 곰팡이가 핀 sample에서 백금구로 곰팡이를 채취한 뒤 cover glass 위 배지에 접종한다. Hollow glass 위에 멸균된 증류수를 한 방울 떨어뜨리고, 주변에 vaseline을 바른 후 cover glass를 뒤집어 덮어 25℃에서 5-6일 배양한 뒤 곰팡이를 현미경으로 관찰한다.

 

4. Results & Discussion

본조에서는 고추장의 표면에서 자라난 검은색 곰팡이를 채취하여 YM agar에 접종한 뒤 hollow glass 위에 증류수를 한 방울 떨어뜨리고 주변에 vaseline을 바른 후 agar와 증류수가 닿게 뒤집어 덮어 배양하고 현미경으로 곰팡이를 검경했다.

Figure 1은 본인이 실험한 곰팡이의 검경 사진으로 균사체의 모습을 확인 할 수 있다. 균사체 안에 하얀 점을 확인 할 수 있는데, 이는 핵이라고 추측한다. 격벽은 확인 할 수 없었다. 포자 또한 확인할 수 없다. 관찰된 균사는 표면의 균사로 Vegetative hyphae로 추정된다. Figure 2와 Figure 3는 조원의 현미경 검경 사진으로, 전자에서는 포자를 관찰할 수 없으며, 격벽이 없는 균사체를 확인할 수 있다. 후자에서는 격벽이 없는 균사와 포자를 관찰 할 수 있다. 포자가 뭉쳐있는 것은 알 수 있다. 시료의 곰팡이는 검은색을 이었고, 재양한 곰팡이는 인색과 검은색이 혼합되어있는 모습이었으나 현미경으로 포자의 색이나 균사의 색을 관찰하기는 어려웠다. 포자의 종류에는 유성포자와 무성포자가 있는데, 포자의 모습은 확인 할 수 있지만 유성포자가 균사에 연결되어있는 모습인 Conidia나 Sporangiospores은 관찰할 수 없었다. 포자가 따로 관찰되는 것을 보아 존재했지만 찾지 못한 것으로 추정한다. 관찰되는 포자가 뭉쳐있는 모습이 일정하지 않은 것을 보아 Sporangiospores일 것으로 예상한다. 무성포자는 자낭, 접합, 담자형이 있는데 본 검경으로는 무성포자의 형태를 알 수 없었다.

곰팡이의 형태학적인 성질으로는 격벽의 유무, 균사체의 색, 유성,무성 포자, sporangium 의 성질, conidia 의 형태, Rhizoid, stolon, foot cell등이 있다. 본 실험에서 관찰한 곰팡이에는 격벽이 없고, 색이 없고, Sporangiospores인 곰팡이라고 추정한다.

격벽이 없음으로 mucoraceae과이며 Zygomycetes group 이라고 추정한다. Mucor 속과 Rhizopus 속이 포함되어있다. Mucor 속은 접합균류로서 거미줄곰팡이와는 근연관계이나 가근을 갖지 않으며 증식은 빠르다. 바로 선 포자낭병의 말단에 점질의 포자낭을 만들고 성숙하면 찢어지거나 용해하여 구형 또는 타원형의 포자를 방출하지만 기둥축은 끝까지 남는다. 초기에는 격벽을 갖지 않지만 후에 포자낭 등의 기관이 형성될 때 생긴다. 계통이 다른 균주와 유성생식에 의해 암색, 표면이 돌기장의 접합포자를 만든다. 토양 등 자연계에 널리 분포하며 야채나 식품을 변패시킨다. 특히 수분활성이 높은 환경을 좋아하며 식염농도가 높아지면 증식이 억제된다. 어느 종의 것은 혐기적 조건에서 증식하여 약하지만 발효능을 갖는다. 본 속에는 적어도 20종이 존재하지만 Mucor racemoscus가 가장 널리 분포하고 있으며 0℃ 이하에서도 증식이 가능하다.

Rhizopus 속은 거미줄곰팡로, 곰팡이 등과 함께 접합균류에 속한다. 증식이 빠르고, 포자낭을 형성하지만, 병의 기부에 가근을 갖는다. 포자 방출 후의 주축은 종종 우산형을 보인다. 자낭포자는 비교적 대형. 표면에 줄무늬 모양을 갖는다. 접합포자는 솜털곰팡이와 마찬가지이고 계통이 다른 균주와의 사이에서 형성된다. 딸기의 런너와 같은 활 모양의 포복지가 생기는 것도 있다. 식품의 변패균으로서는 Rhizopus stolonifer가 곡식, 견과류 등에도 증식하지만 딸기 등의 신선한 과실에 주로 증식한다. 이 균은 pectinase 활성이 강하고 제관과정에서 완전히 실활하지 않으면 보관 중에 과실의 연화를 야기하는 경우도 있다. Mucor속과 마찬가지로 혐기적 조건하에서도 증식이 가능하다. 본 속은 발효식품 제조상 중요한 균이 많아 Rhizopus deldmar나 Rhizopus javanicus는 glucoamylase 활성이 강한 전분의 당화(Amylo process)에 쓰인다.

Mucor 속은 식염농도가 높아지면 증식이 억제됨으로 염농도가 높은 고추장에서 자라기 어려웠을 것이라고 추정한다. 그러므로 관찰된 곰팡이는 Rhizopus 속의 곰팡이라고 추정한다.

격벽 유무의 확인을 1000배로 관찰했다면 보다 정확하게 알 수 있을 것이라고 생각한다. 또한 균사의 모습을 많이 확인하기는 어려웠던 것을 보아 곰팡이가 아직 충분히 자라지 못했다고 생각한다. 적절한 온도에서 오래 배양한다면 정확하게 관찰 할 수 있을 것이라고 생각한다. 또한 동정을 위한 추가 실험을 한다면 관찰한 곰팡이의 동정을 확실하게 할 수 있을 것이라고 생각한다.

[논문] 곰팡이의 균종을 달리하여 만든 밀가루 누룩의 탁주양조 적성 실험에서 Aspergillus oryzae, Rhizopus japonicus 또는 Aspergillus usamii mut, shirousamii를 접종하여 제조한 밀가루 누룩의 탁주양조 적성을 조사하고 이들의 효율적인 사용방법에 대한 연구를 하였다. 각 곰팡이는 amylase의 활성도, protease의 활성도에서 차이를 보였으며 누룩의 술덧에서는 산도와 아미노산과 같은 차이를 유발하기도 했다. 또한 사용한 곰팡이에 따라 에탄올의 함량도 다르게 나타났으며 부유물의 침강속도 역시 차이가 났다. 이 논문에서는 Aspergillus oryzae 누룩과 Rhizopus japonicus 누룩을 병용하여 제조한 탁주가 관능평가에서 가장 좋은 평가를 받았다.

[논문] 콩알메주 발효의 pilot system에 Mucor circinlloides, Mucorv hiemalis, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer를 각각 접종하여 45시간 발효시킨 후 메주의 효소활성, 영양성분, 향기 성분 등을 분석하고 발효된 메주로 한식간장을 제조하여 제품의 관능을 평가하였다. 아미노산, 유리당, 지방산, 유기산의 분석 결과, 각 균주에 따라 특징적인 구성비를 보여주었다. Amylase 활성과 당류의 분해도는 Rhizopus oryzae가, protease 활성은 Rhizopus stolonifer가 가장 높았으며 lipase 활성과 지질의 분해도는 각 균주별로 큰 차이를 보이지 않았다. 메주의 향기 성분 분석 결과 Mucor속 균주들은 Aspergillus와 비슷한 향기성분을 생산하는 것으로 조사되었고 Rhizopus속 균주들은 Bacillus의 비슷한 향기성분을 생산한다. 각 메주로 간장을 제조한 결과, M. hiemalis와 R. stolonifer 실험구가 좋은 관능평가를 보여 이 두 균주를 이용한 콩알메주로 한식간장을 제조할 수 있는 가능성을 제시하였다.

 

5. Homework

(1) 곰팡이란?(일반적인 특징, 식품 응용 등 자세히)

Introduction에 서술했다.

(2) Mold morphology(+ 자신이 직접 관찰한 곰팡이가 형태학적으로 어디에 속하는지 -> Result에 기술)

result에 서술했다.

 

6. References

1) 강춘기 외 6명. 식품미생물학. 2004. 지구문화사, p. 29-53.

2) 남주현 외 2명. 식품미생물학. 2003. 신정도서출판, p. 24-50.

3) 고하영 외 1명. 이론 식품미생물학. 2005. 석학당, p. 53-66.

4) [논문] 소명환. 곰팡이 균종을 달리한 밀가루 누룩의 탁주양조 적성. 1995. 한국식품영양학회지 8권 1호, p. 6-12.

5) [논문] 김동호 ,김승호. Mucor 및 Rhizopus속 균류를 이용한 콩알메주 발효의 생화학적 특성. 1999. 한국식품과학회지 한국식품과학회지 v.31 no.1, p. 176 – 182.

6) [네이버 지식백과] 리조푸스속 (식품과학기술대사전, 2008. 4. 10.) (2021.04.27. 19:00) https://terms.naver.com/entry.naver?docId=293324&cid=60262&categoryId=60262

7) [네이버 지식백과] 솜털곰팡이 속 [genus Mucor] (식품과학기술대사전, 2008. 4. 10.) (2021.04.27. 19:00) https://terms.naver.com/entry.naver?docId=294589&cid=60262&categoryId=60262