MTT assay & cell counting : 식품면역학실험 레포트 (2)

1. Introduction

 

1.1 MTT assay 의 원리 

 

-MTT는 4.5-디메틸디아졸-2-일-2,5-데페닐테르라졸리움 프로미드으로 담황색을 띄는 물질입 니다. 세포의 증식과 성장 및 사멸도 등의 세포활성을 측정하는 MTT assay에 사용됩니다. 또 이 방법은 식품의 기능성 성분과 다양한 생리활성물질이 세포에 미치는 영향을 평가하기 위한 연구에 널리 응용되고 있습니다.

 

-MTT분석은 살아있는 세포의 미토콘드리아의 탈수소효소 활성에 근거하며 이 효소에 의해서 황색의 수용성 MTT 테트라졸름, tetrazolium의 ring 구조가 끊어진 청자색을 띄는 비수용성 의 MTT formazan으로 환원되어 청자색의 불용성 MTT 포마잔으로 변하는 원리를 이용합니 다./이때 생성된 포마잔의 양과 이로부터 보여지는 청자색의 세기가 세포의 생존률과 비례합 니다. 따라서 황색이 많으면 세포가 힘이 없거나 죽었기 때문에 미토콘드리아의 활성이 멈추 어 탈수소효소가 정상적으로 작동하지 않아 MTT를 포마잔으로 바꾸지 못한 것 이라고 이해 하면 됩니다. 반대로 청자색이 많이 보이면 생생하게 살아있는 세포의 탈수소효소가 일을 했 다는 의미로 해석할 수 있습니다. 그 후에 생성된 포마잔의 흡광도를 측정함으로써 세포의 성 장과 사멸도에 대한 정확한 수치를 얻을 수 있습니다.

 

1.2 마지막에 DMSO 넣어주는 이유

 

-MTT 포마잔은 불용성 물질로 세포 내에 축적되는데 이때 DMSO은 유기용매이기 때문에 세 포막을 파괴하고 이를 용해시킨 후 세포내에 있는 결정들을 세포 밖으로 꺼낼 수 있게 해주는 역할을 합니다.

 

-위와 같은 역할이기 때문에 DMSO 대신 NaOH나 sodium dodecyl sulfate, Triton X-100 과 같은 계면활성제를 포함한 혼합액으로 사용할 수 도 있습니다. -결과는 흡광광도계를 이용해서 빛의 투과성을 보고 얼마나 MTT가 Formazan으로 변했는지 를 확인하는데, 이때 결정화된 부분이 있다면 빛의 투과성으로 정도를 확인하는 만큼 오류가 생길 가능성이 높습니다. 따라서 이 결정을 액체 상태로 녹여서 오류를 최소화하는 목적으로 도 DMSO를 사용하게 됩니다.

 

2. Material 

 

2.1 MTT assay

RAW 264.7 cell cultured in 96-well culture plate 

Micropipette & tip

Multipipette

Incubator

Microscope 

Waste 통

Foil 

Microplate reader 

2D Shaker 

Centrifuge 

MTT reagent (5 mg/mL) 

DMSO 

 

2.2 cell counting 

HT-29 cell resuspension 

Hemocytometer 

Cover slip 

Micropipette & tips 

Microscope 96 well plate

PBS

Complete DMEM

Trypan blue

Trypan blue

Complete DMEM

1XPBS

 

 

3. Method 

 

3.1 MTT assay

1. 96-well plate에 RAW 264.7 cells을 2x10^5 cells/mL로 seeding하여 약 18시간 배양한 다. (total volume 200 μL)

2. 배양 후, 배지를 전부 제거하고 C-DMEM에 희석한 whey를 농도별로 처리한다.

3. Incubator(37 ℃. CO2)에서24시간 배양한다.

4. 각 well 에서 supernatant를110 μL 걷어내고 90 uL만 남긴다.

5. 실험실 불을 끄고 MTT reagent를 최종농도가 0.5 mg/mL이 되도록 10 μL를 각 well에 넣어준다. (avoid light)

6. Incubator에서 2~4시간동안 빛을 차단하여 incubation한다. (호일로 plate 감싸서 진행)

7. 중간에 색 변화를 현미경으로 확인하고 보라색 결정 형태를 확인한다.

8. Centrifugation (2000 rpm, 5 min, RT)으로 cell down (생략)

9. 상등액을 제거한 후 DMSO 100 μL을 넣어 2D shake에서 약 10분 정도 dark blue crystal을 용해시킨다.

10. Microplate reader를 통해 570 nm에서 O.D를 측정한다.

 

3.2 cell counting

1. Hemocytometer의 chamber와 coverslip을 ethanol을 이용하여 닦아준다. 

2. 96-well plate의 well에 각각 A와 B로 표시 후 A well에 40 μL의 PBS를 분주한 후, cell suspension액을 10 μL 분주한다. 

3. A well을 pipetting 한 뒤 A well의 액을 10 μL 취하여 B well에 분주한다. 

4. B well에 trypan blue 10 μL를 분주한 뒤. B well의 10 μL를 hemocytometer 로 분주한 다. 현미경에 hemocytometer를 올려 두고 cell counting을 진행한다. 

5. Viable cells을 counting 한다. (viable seen as bright, non-viable stained blue) 6. Viable cells의 concentration을 계산한다. 

 

4. Results

4.1 MTT assay

 

먼저 저희 2조의 결과 값을 보면 whey의 첨가율에 따라서 생존률의 일정한 변화가 보이지는 않습니다. 0.1보다 아무것도 첨가하지 않은 NT의 생존률이 약간 더 높지만, 1이나 10정도의 첨가율이 NT 값보다 높기 때문입니다. 따라서 해석을 하면 적은양인 0.1을 첨가하는 것 보다 는 아예 안 넣거나, 1에서 10정도의 양을 첨가하면 세포에 더 좋다는 것을 알 수 있습니다.

(+이러한 해석은 고찰에 써 주세요! 그리고, 다른 실험적 요인으로 인해 마치 세포 목성이 존재하는 것과 같이 보일 수 있는터라 이러한 해석은 좋지 못합니다 라고 코멘트 받음)

 

결과를 도출하는데 비교할 대상이 많지 않아 1조와 2조의 값을 모두 가지고 그래프를 만들 어 본 결과 2조 단독의 결과와는 약간 다른 모습을 보였습니다. 위는 1조와 2조의 결과를 모 두 합한 값입니다. 이 결과를 보면 NT 값과 나머지 값 사이의 일정한 변화나 큰 차이가 없음 으로 실험이 잘못되었거나 whey의 청가 또는 첨가율이 큰 의미가 없다고 해석할 수 있습니다

 

4.2 cell counting

 

조원끼리 한 부분씩 맡아서 센후 합친 숫자가 144였습니다. 그 후 (144/4) *2*10^4를 한 뒤 과학적 표기법으로 바꾸어서 7.2*10^5가 나왔습니다.

 

5. Discussion

5.1 MTT assay.

 

-세포의 사멸정도에 따라서 육안으로도 미세한 색의 차이를 구분 할 수 있고, 또 작은 한 plate 안에 여러 well을 사용해 다양한 조건에서 실험을 하고 바로 옆에서 비교를 한다는 정 이 굉장히 효율적인 방법이라고 생각이 들었습니다.

 

-MTT가 빛에 약한 시약이기 때문에 항상 은박지에 싸 서 사용하며 불을 다 끄는 등 최대한 빛에 노출되지 않도록 하면서 실험을 진행했습니다 하지만 가장 강력하고 직접적인 빛인 현미경에서 관찰 할 때 직접 쏘이는 불로 인해 영향을 받지 않을까라는 생각을 하게 되었습 니다. 하지만 이는 관찰을 위해서는 어쩔 수 없는 부분임으로 최대한 밝기를 조정해서 관찰 하는 것이 좋고 시간적 여유가 된다면 2~4시간 방치이기 때문에 2시간 후에 확인하고 또 한 시간 후에 확인 하는 것 보다 처음부터 4시간에 가까운 시간에 확인을 해서 현미경 빛 에 노출되는 시간을 줄이는 것도 좋은 방법일 것 같다고 생각했습니다.

- MTT assay를 할 때 96-well에 세포를 seeding 하기 전에 cell counting을 통해서 적당한 양의 세포수가 있는지를 확인하고 많다면 희석하고 적다면 그대로 사용하는 방식으로 세포 수를 일정하고 조절해서 실험을 시작해야 실험 결과에 오류가 발생하지 않습니다

 

-실험에 사용한 RAW 264.7 cell은 부착형 세포이기 때문에 well의 바닥에 붙어서 자랍니다. 실험초반에 cell을 키운 후에 왜 상등액을 따서 버릴 때 세포가 딸려 올라오지 않고 위에 있는 배지 혹은 whey만 제거할 수 있습니다.

 

-96-well plate로 실험을 하는 것은 처음이었는데 칸이 생각보다 너무 좁고 각 well 사이의 간격이 좁아서 상등액을 제거하는데 전체 plate를 기울여서 잡고 바닥에 붙지 않도록 벽면 에 대거나 중간쯤에 파이펫의 끝을 넣고 빨아들이는데도 아직 익숙하지 않아서 아래에 있는 세포를 긁거나 손상을 입혔습니다. 파이펫의 길이가 긴것도 아닌데도 정확하게 미세하게 수 면이 내려감에 따라서 같이 조금씩 내려가면서 빨아들여야하는데 파이펫팅이 익숙하지 않아 well 의 바닥면을 건드려서, 세포가 쭉 붙어있어야 하는데 가끔 파인 부분이 상등액을 모두 제거하고 DMSO를 넣기 전에 확인해보니 육안으로도 확인이 가능했습니다. 저희 조의 실험 에 오차가 있다면 그 부분이 가장 크게 작용했을 것입니다. 심지어 골고루 까진 것이 아니 고 각 농도별로 다른 사람이 했기 때문에 까진 정도가 달라서 실험결과가 더욱 정확하지 못 하게 나온 것 같습니다. 점점 더 숙련도를 높여나가고(숨을 참고 하거나)시간이 걸리더라도 지금보다 더 천천히 하면서 정확도를 높여나가야 할 것 같습니다. 또한 안전하게 더 잘 빨아들이기 위해서 plate를 기울였는데 자꾸 위에 well에 있는 용액이 아래로 흐를까봐 무서워서 각도를 크게 기울이지 못했습니다. 다음부터는 안전한 범위 안에 서 더욱 기울여서 실험을 하겠습니다.

 

-결정이 생긴 것을 현미경으로 확인 했을 때 세포가 포도송이처럼 뭉쳐진 것과 유사한 크기 로 세포의 포도송이 근처에 상당히 많은 양이 결정이 되어서 있는 것을 발견했습니다. 따라서 DMSO로 확실하게 녹이지 않으면 결과에 오류를 범할 수 있음으로 정확하게 녹이는 것 이 중요하다고 생각했습니다.

 

-실험에 대해서 조금 더 알아보았는데 formazan dye의 최대 흡광도는 540 nm 부근이라는 것을 알았습니다. 또 세포의 생리적 상태나 세포의 종류에 따라 미토콘드리아 탈수소효소 활성의 차이가 나타날 수 있다는 것을 알게 되었습니다. 그리고 처음에 상등액을 딸 때 부착형 세포이기 때문에 비교적 간편했다고 느꼈는데, 그 때문에 이 방법은 suspension cell 에 적용하기 어려운 단정도 있다는 것을 알게 되었습니다. 하지만 비교적 간편하면서도 정 확하게 세포 성장 및 사멸도의 변화를 평가할 수 있을 뿐만 아니라 multi-well plate를 사 용하여 대량의 시료를 동시에 측정할 수 있기 때문에 in vitro상에서의 세포활성을 평가하 는데 널리 사용되고 있다고 합니다.

 

5.2 cell counting 

 

-다른 조들과 같은 well 예 있는 세포를 이용해 이론적으로는 모두 같은 값이 나와야 하지만 각 조마다 세포의 개수가 다르게 나온 이유는 모두 실험에서 발생한 오차들이 합쳐져서 발생한 것 같습니다.

 

-먼저 사용한 세포는 HT-29로 부유형세포가 아닌 부착형세포입니다. 따라서 같은 곳에서 따 와서 희석을 했다고 하더라도 세포가 용액 전체에 균일하게 있지 않았을 확률이 높습니다. 또 한 희석하는 과정. 또 파이펫팅을 하는 과정에서 세포가 손상되었을 가능성이 있습니다

 

-두번째는 hemocytometer의 사용과정에서 일어났을 수 있습니다. 수직으로 떨어뜨리는 줄 알았는데 알고보니 측면에서 파이펫을 꼽는 형태로 고정시키고 한번에 축하고 뱉어내는 방식 으로 hemocytometer안에 세포를 떨어뜨리는 방식이었습니다. 이 과정에서 기포가 생가면 안 되는데 저희 조 같은 경우에는 너무 강하게 누르는 바람에 기포가 생겼습니다. 이런 부분에서 오차가 발생했을 것 같습니다. 

 

 -마지막으로 카운팅입니다. 카운팅을 할 때 지금 보고 있는 셀이 센 것 인지 아닌건지 엄청 헷갈렸습니다. 한 사람이 한 구역을 세는데도 오차가 생길 위험이 그 렇게 큰데 실험에 참여한 모두가 각자 다른 구역을 카운팅 했기 때문에 덜 혹은 더 카운팅 했 을 것이라고 생각합니다. 이는 저의 경우 눈금을 보고 가로방향으로 한 줄씩 빠르게 스피드를 높이는 방식으로 해결했습니다. 그랬더니 어지럽게 보임에도 불구하고 2번이나 확인했는데 차이가 없었기 때문입니다. 

 

6. References

-김주현, 홍정일. (2018). 빛, 용매와 zinc protoporphyrin에 의한 MTT 포마잔의 화학적 동태 변화. 한국식품과학회지, 50(1). 1-7.

-박경아, 최현아, 김미리, 최유미, 김현정, 홍정일. (2011). MTT formazan의 발색에 미치는 zinc protoporphyrin의 영향. 한국식품과학회지, 43(6). 754-759.